Hızlı Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri

1973 kez okundu

9 ay önce eklendi

Ana Sayfa » Makale-Yöntem » Mikrobiyolojik Analiz» Hızlı Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri

 
Mikrobiyoloji uygulamalarında önemli bir yere sahip olan hızlı yöntemler klinik, gıda ve çevresel örneklerde bulunan patojen mikroorganizmalar ve onların metabolitlerinin erken tespiti, izolasyonu, identifikasyonu ve sayımı için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. İlk olarak 1960’ların ortalarında geliştirilmeye başlayan bu yöntemler, minyatürize biyokimyasal, immunolojik, genetik ve biyosensör tekniklerini kapsamaktadır.
 
Minyatürize biyokimyasal identifikasyon yöntemleri 1965 ile 1975 yılları arasında geliştirilmiş, 1975 ile 1985 yılları arasında kalan süre immunolojik test yöntemlerinin altın çağı olarak adlandırılmıştır. Genetik tanı yöntemleri ile polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) uygulamaları 1985 ile 1995 yılları arasında gelişim göstermiştir. 1995 yılından günümüze kadar ise biyosensör ve mikroarray test sistemleri, çeşitli örneklerde bulunan patojen organizmaların direk tanısı amacıyla geliştirilmiştir. Bu derlemede anlatılan immunolojik testler, manüel ve otomatik ELISA (Enzyme Linked İmmunosorbant Assay) testlerini, lateral migrasyon immunoassay, lateks aglütinasyon testlerini ve immunomanyetik separasyon yöntemlerini kapsamaktadır. Genetik tanı yöntemlerinden birisi olan PZR, patojen mikroorganizmaların doğru tanısını güçlendirmek için son yıllarda daha da geliştirilmiştir. Hızlı testlerin güvenirliği ile ilgili bir çok araştırmanın sonuçları göstermiştir ki; bu testler ucuz ve hızlıdır ayrıca yüksek özgüllük ve duyarlılığa sahiptirler. Bu yazıda hızlı testlerin çalışma prensipleri sunulmuştur.
 
Mikrobiyolojik yöntemler; geleneksel ve hızlı yöntemler olmak üzere ikiye ayrılır.
 
Geleneksel yöntemler halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Hızlı yöntemler terimi, farklı tiplerdeki minyatürize biyokimyasal kitleri, antikor temelli serolojik testleri, nükleik asit hibridizasyon kökenli yöntemleri ve biyosensörleri kapsamaktadır. Bu test yöntemleri manuel, yarı otomatik veya tam otomatik kullanıma sahiptirler.
 
Hızlı yöntemler; klinik, gıda ve çevresel örneklerde bulunan bakteri, mantar, virüs ve protozoon gibi mikroorganizmalar ile onlara ait metabolitlerin izolasyonu, identifikasyonu, erken tanısı, sayımı ve bakterilerin antibiyotiklere olan duyarlılıklarının belirlenmesinde kullanılmaktadır. Bu yöntemler yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olmalı, ayrıca ucuz ve kısa sürede sonuç vermelidir. Günümüzdeki yöntemlerin tamamı bu sayılan özellikleri taşımaktadır.
 
MİNYATÜRİZE BİYOKİMYASAL İDENTİFİKASYON YÖNTEMLERİ
 
Mikroorganizmaların identifikasyonunda kullanılan geleneksel biyokimyasal testlerde yoğun işgücü ile yüksek miktarda ayıraç ve besiyeri tüketilmektedir. Minyatürize biyokimyasal yöntemlerde ise dehidrate ayıraçlar veya kullanıma hazır besiyerleri kullanılmaktadır. Bu teknikler genellikle “modern biyokimyasal identifikasyon teknikleri” adı ile anılmakta ve günlük laboratuvar uygulamalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Minyatürize biyokimyasal yöntemlerde, hazır bulunan çeşitli sıvı veya katı besiyerlerine saf kültürler inokule edilip inkübe edilir ve enzimsubstrat ilişkisine bağlı oluşan renk değişimi ya da gaz oluşumu ile bakteri belirlenir. Sonuçlar tanı çizelgeleri ile karşılaştırılabileceği gibi veritabanları ile de analiz edilebilir.
 
Bu yöntemler, önceleri enterik bakterileri (Salmonella, Shigella, Proteus, Enterobacter vb.) identifiye etmek için tasarlanmışken daha sonraları fermentatif olmayan bakteriler, Gram pozitifler, anaeroblar ve mayaların identifikasyon ve antibiyogramlarını yapabilecek şekilde geliştirilmişlerdir. Bu sistemlerde kullanılan test kartları, değişik büyüklüktedirler ve antibiyotik veya identifikasyon substratları içeren değişik sayıda mikro kuyucuklardan oluşmaktadırlar. Plastik kartların her gözünde farklı ayıraçlar bulunmaktadır. Bilinmeyen kültürün sıvı formu plastik kartların her bir gözünün vakum dairesinden verilmekte ve kart bir inkübatöre kaldırılarak 4-12 saat inkübe edilmektedir. Otomatik yöntemlerde, sistem belirli sürelerle her bir kartı taramakta ve renk değişimi veya gaz oluşumunu her bir göz için veritabanı ile karşılaştırmaktadır.
 
 
 
İlk karşılaştırmalı analizlerin çoğu klinik örneklerinin değerlendirilmesine odaklanmıştır. Minyatürize diagnostik sistemlerin kriterlerinin belirlenmesi amacıyla yapılan ilk çalışmalarda, minyatür sistemlerin geleneksel yöntemlerden daha hızlı, daha doğru ve daha ucuz oldukları ve ayrıca insan gücünden ve çalışma alanından tasarruf sağladıkları sonucuna varılmıştır. Başlangıçta, hızlı tanı kitlerinin her bir gözündeki renk değişimi gözle okunup daha sonra elde edilen manuel identifikasyon kodu kullanılarak mikroorganizma belirlenirken, son zamanlarda diagnostik tanı şirketleri bilinmeyen kültürlerin identifikasyonlarının hızlı ve doğru yapılabilmesi için bilgisayarlı otomatik okuyucular geliştirmiştirler.
 
Mikrobiyolojik yöntemlerin minyatürizasyonu, materyal ve zaman kazancı ile ticari mikrobiyolojiye hızlı ve kolay çalışma imkanı sağlamıştır. Geliştirilen sistemler ile özellikle rutin teşhis laboratuvarlarında kısa sürede fazla sayıda örnek işlenebilmektedir. Ayrıca bu sistemler gelişmiş laboratuvarların çok sayıda kültür işlenmesi gereken çalışmalarında ve birçok araştırmada kullanılabilmektedir.
 
İMMUNOLOJİK YÖNTEMLER
 
Mikroorganizmaların belirlenmesi ve karekterizasyonunda antikor antijen reaksiyonu yıllardır uygulanmaktadır. Ayrıca, düşük moleküler ağırlığa sahip mikotoksin, pestisit veya veteriner ilaçları gibi gıda kontaminantlarının belirlenmesinde de tercih edilmektedir. Bir immunolojik yöntemin spesifitesini büyük ölçüde kullanılan antikorun spesifitesi belirlemektedir. İmmunolojik yöntemlerde üç çeşit antikor kullanılmaktadır: Poliklonal antikorlar, monoklonal antikorlar ve rekombinant antikorlar. Antijen-antikor reaksiyonu tüm patojenlerin hızlı belirlenmesi için güçlü bir sistemdir. Bazı sistemler yüksek oranda otomatize edilmişken bazı sistemler ise basit kullanıma sahiptir. Bu testler şöyle sınıflandırılabilir:
 
1. Lateks Aglütinasyon Testleri
 
Antikor kaplı ve boyalı lateks ya da kolloidal altın partikülleri, hızlı serolojik identifikasyon ya da saf bakteri kültür izolatlarının teşhis ve tiplendirilmesinde kullanılır. Antijen ile antikorun birleşmesi sonucu gözle görülür aglütinasyon şekillenir. Ters lateks aglütinasyon testleri çözünebilir antijenler içindir ve çoğunlukla toksinlerin aranmasında kullanılırlar.
 

 
2. Otomatik ve Manuel ELISA (Enzyme-Linked İmmunosorbent Assay) Yöntemleri
 
Antijen antikor reaksiyonunu gerçekleştirmek için birçok yöntem olmasına rağmen son yıllarda en çok kullanılan yöntem ELISA testidir. Bu yöntemde, antijen ya da antikor bir enzimle işaretlenmekte ve immunolojik reaksiyon, enzimatik bir aktivite sonucu ölçülmektedir. ELISA testinin direkt, indirekt ve sandviç ELISA gibi farklı şekilleri olmasına rağmen en sık kullanılanı sandviç ELISA yöntemidir.
 
 
 
Patojen mikroorganizmaları ve toksinlerini belirlemek için birçok ELISA testi geliştirilmiştir. Fakat bunun yanında ELISA’nın manuel prosedürü çok zahmetli olduğu için son zamanlarda bazı ELISA testleri (VIDAS, Assurance EIA, Transia ElisamaticII, Detex vb) tamamen otomatik hale getirilmiştir. Bu sistemler ile Listeria, Listeria monocytogenes, Salmonella, E.coli 0157, stafilakokkal enterotoksin ve Campylobacter gibi patojen ve toksinleri kısa sürede otomatik olarak teşhis edilmektedir. Günümüzde kullanılan birçok ELISA kiti yüksek standarda sahiptir ve otomatik olarak çalıştıkları için hız ve verimi arttırmakta ve insan hatalarını azaltmaktadırlar.
 
3. Lateral Migrasyon İmmunoassay (İmmunokromatografi) Yöntemi
 
İmmunoloji alanındaki diğer bir gelişme ise antijen-antikor ilişkisine dayanan “Lateral Flow Teknoloji”sinin kullanımıdır. Bu test formatında da sandviç prosedürü kullanılır fakat ikinci antikor lateks partikülleri veya koloidal altın ile bağlanmıştır. Zenginleştirilmiş örnek bir seri dairelere transfer edilir ve yıkama işlemine gerek yoktur. Bu sistemde, test kiti üç reaksiyon bölgesine sahiptir. Birinci kuyucuk hedef antijenle reaksiyona girecek antikorları içerir. Bu antikorlar renk partikülleri ile bağlanmıştır. Sıvı formdaki örnek (bir gece süreyle zenginleştirilmiş) bu kuyucuğa eklenir eğer örnekte aranan organizma varsa antikorlarla reaksiyona girecektir. Oluşan kompleksler kapiller hareket ile ikinci bölgeye lateral olarak yığılacaktır. İkinci bölge, hedef antijen ile reaksiyona girebilecek şekilde düzenlenmiş ikinci bir antikor grubu içerir. Eğer aranan mikroorganizma örnekte varsa oluşan kompleksler bu ikinci antikor grubunca kaplanacaktır ve birinci antikor grubunun renk partikülleri ile kaplı olmasından dolayı mavi bir çizgi hattı oluşacaktır. Fazla antikorlar üçüncü bölgeye yığılmaya devam edeceklerdir. Üçüncü bölge ilk antikorlar ile reaksiyona girebilen diğer bir üçüncü çeşit antikora sahiptir. Böylece üçüncü bölgede ikinci bir mavi hat oluşacaktır. Bu çizgiye “kontrol” çizgisi denilmektedir ve sistemin çalıştığını göstermektedir. Tüm bu prosedürler yalnızca 10 dakikada oluşmaktadır ve gerçek bir hızlı testtir.
 
 
 
Bacillus anthracis, E. coli 0157, Salmonella, Listeria ve Avian influenza gibi patojenlerin çeşitli örneklerden hızlı tespiti ve identifikasyonu için çeşitli testler geliştirilmiştir. Örnekler 8-24 saatlik zenginleştirmeye tabi tutulduktan sonra test kutusuna aktarılmaktadır. Sadece kontrol çizgisinin oluşması sonucun negatif olduğunu, hem kontrol çizgisinin hem de test çizgisinin oluşması sonucun pozitif olduğunu gösterir.
 
4. İmmuno-Manyetik Seperasyon (IMS) Teknolojisi
 
Bu yöntemde, metalik partikülleri antikorlarla kaplanmakta ve milyonlarca metalik partikül şüpheli sıvı numuneye eklenmektedir. Örnek bir saat kadar karıştırıldıktan sonra partiküllerdeki antikorlar antijen ile bağlanmaktadır. Reaksiyondan sonra tüp manyetik güç kaynağına yerleştirilip partiküller mıknatısın yardımı ile tüpten uzaklaştırılır. Daha sonra bu metal partiküller selektif agar, ELISA, PZR ya da diğer mikrobiyolojik yöntemler ile saf kültür olarak elde edilebilirler. IMS sistem, gıdalardan patojenlerin belirlenmesinde zenginleştirme ve ön zenginleştirme basamaklarından en az bir gün tasarruf sağlamaktadır.
 
 
 
Son zamanlarda birçok tanı sistemi (ELISA, PZR vb) immuno-manyetik kaplama sistemi ile kombine edilmiştir. Bu sayede inkübasyon süresi kısaltılmış ve duyarlılık arttırılmıştır.
 
GENETİK YÖNTEMLER
 
Mikroorganizmaların fenotipik özellikleri üreme şartlarına bağlıdır. Bu üreme şartlarına örnek olarak, ısı, pH, besin ihtiyacı, oksidasyon-redüksiyon potansiyeli, çevresel ve kimyasal stresler, toksinler vb. verilebilir. Bakteri ve hücrelerin genotipik özellikleri ise çok stabildir. Bakteriyel kültürlerde doğal mutasyon oranı yüz milyonda birdir. Son yıllardaki gelişmeler genetik testlerde diagnostik mikrobiyoloji içerisinde identifikasyon ve doğrulayıcı testler olarak kullanılmasını sağlamıştır. Bilinmeyen bir bakteriye ait DNA dizisinin bilinen bir DNA probu ile hibridizasyonu genetik testlerin ilk aşamasını oluşturmuştur. Genetrak Sistem (Framingham) patojenlerin enzimle işaretli DNA probları kullanılarak tespit edilmesi için geliştirilmiş hassas bir yöntemdir.
 
 
 
Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), çeşitli örneklerde bulunan patojen mikroorganizmaların hızlı ve doğru teşhisi için son yıllarda hızlı bir gelişim göstermiştir. Bu yöntemde, aranan mikroorganizmaya ait hedef gen bölgesinin kısa oligonükleotid parçaları ile amplifikasyonu yapılmakta ve çoğaltılan DNA parçaları elektroforez yardımı ile görüntülenmektedir. Bu yöntemin, çeşitli örneklerde bulunan mikroorganizmaları teşhis etmede, altın standart olarak kabul edilen kültür yöntemi kadar güvenilir olduğu tespit edilmiştir. Birçok mikroorganizmanın tespit ve identifikasyonu için çok sayıda PZR protokolü geliştirilmiştir.
 
BİYOSENSÖR KÖKENLİ YÖNTEMLER
 
Biyosensörler, bünyesinde biyolojik bir duyargacı bulunan ve bir fizikokimyasal çeviriciyle birleştirilmiş analitik cihazlar olarak tanımlanmaktadır. Biyosensörlerin amacı, bir veya bir grup analit (analiz edilecek madde) miktarıyla orantılı olarak sürekli sayısal elektrik sinyali üretmektir. Biyosensör sistemleri üç temel bileşenden oluşmaktadır. Bunlar; seçici tanıma mekanizmasına sahip “biyomolekül/ biyoajan”, bu biyoajanın incelenen maddeyle etkileşmesi sonucu oluşan fizikokimyasal sinyalleri elektronik sinyallere dönüştürebilen “çevirici” ve “elektronik” bölümlerdir. Biyosensörün görevi biyolojik bir olayın elektriksel sinyale dönüştürülmesidir. Biyosensörler biyokomponentler (reseptör) ile fiziksel komponentlerden (transdeeuser) oluşurlar. Yapılarında görev alan biyokomponentler çoğu kez biyoreseptör olarak adlandırılırlar.
 
 
 
Bunların içinde en yaygın kullanılanlar enzimler ve antikorlardır. Enzim – substrat ve antikor – antijen arasındaki etkileşimin ilk adımı analitlerin protein moleküllerine bağlanmasıdır. Biyosensörlerin, klinik, teşhis, tıbbi uygulamalar, süreç denetleme, kalite kontrol, tarım ve veteriner hekimlik, bakteriyel ve viral teşhis, ilaç üretimi, endüstriyel atık su denetimi, madencilik, askeri savunma sanayi gibi alanlarda kullanımı söz konusudur. Biyosensörler, enzim, mikrobiyal, immuno ve DNA– sensörler olarak gruplandırılabilirler. “Detex” sistem bu alandaki otomatize edilmiş bir sistem olupelektroimmunoassay biyosensör teknolojisi kullanılmıştır. Tüm ayıraçlar kullanıma hazır bir şekilde cihazın içinde hazır bulunmaktadır. Test edilecek örnek test kasetine yerleştirilir ve immunolojik reaksiyonlar için ayıraç sekansı otomatik olarak başlar. Reaksiyonlar tamamlanınca sonuç cihaz tarafından rapor edilir.
 
Hızlı yöntemler, yoğun numune akışının olduğu gıda ve hastane laboratuvarları başta olmak üzere tüm mikrobiyoloji laboratuvarlarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda gelişimi ivme kazanan PZR yöntemi, birçok patojen mikroorganizmanın gen sekanslarının belirlenmesi ile yaygın bir kullanım alanına kavuşmuştur. Bu yöntemle bir gün gibi kısa bir süre içerisinde sonuç verilerek zaman tasarrufu da sağlanmaktadır. Gelecekte, biyosensör çeşitlerinin gelişmesiyle, hızlı tanı yöntemlerinin özellikle HACCP programları kapsamında kontaminasyon noktalarının değerlendirilmesinde kullanılacağı beklenmektedir.
 
Kaynak: Mikrobiyolojide kullanılan hızlı tanı yöntemleri Rapid diagnostic methods in microbiology Zeki ARAS,  Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi

Etiketler rheumatoid latex test , hızlı testler , çabuk analiz sonucu , hızlı analiz teknik , mikrobiyolojide hızlı analiz yöntemleri, Minyatürize biyokimyasal yöntemler, immunolojik yöntem, Lateks Aglütinasyon Testleri, Otomatik ve Manuel ELISA yöntemleri, Lateral Migrasyon İmmunoassay (İmmunokromatografi) Yöntemi, İmmuno-Manyetik Seperasyon