Besi Yeri Hazırlık Aşamaları:
Bir gıda maddesinin mikrobiyolojik analizinde sonuçların geçerliliği;
• Analizlere uygun besi ortamının seçilmesine,
• Besi yerinin doğru olarak hazırlanışına,
• Doğru kullanımına bağlıdır.
Ortam bileşimine giren maddeler ve çözeltiler usulüne uygun olarak hazırlanmalı ve saklanmalıdır.
Besiyerleri çok farklı şekillerde hazırlanabilir ve kullanılabilir. Tartılan besi yeri bileşenleri veya dehidre hazır besiyerlerinin hazırlanmasında sırasıyla;
• Tartım
• Kaba aktarma
• Çözündürme
• Berraklaştırma şeklinde yol izlenmelidir.
Tartım
Formüle ve istenen hacme göre hesaplanan hazır besi yeri veya besi yeri bileşenleri hassas terazide tartılır.
Tartımda aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir;
• Tartımda kullanılan terazi 0.01 gram duyarlılıkta olmalıdır.
• Doğrudan besi yeri hazırlanacak erlen ya da balonda tartım yapılmamalı, küçük beher daha doğrusu özel tartım kayıkçıkları kullanılmalıdır.
• Besiyerlerine katılan organik ve inorganik kimyasal maddeler saf olmalı, bozuk, kötü kokulu, nemlenmiş veya son kullanma tarihi geçmiş maddeler kullanılmamalıdır.
• Tartım sırasında her besi yeri bileşeni için ayrı spatül kullanılmalı, tartım çabuk bitirilmeli, tartım sonunda besi yeri kabının kapağı sıkıca kapatılmalıdır.
• Tartım sırasında besi yeri veya besi yeri bileşenlerinin tozlanmamasına dikkat edilmelidir. Çok az da olsa toz bulutu oluşmuş ise kesinlikle solunmamalıdır.
• Besi yeri veya besi yeri bileşenleri deriye ve özellikle göze temas etmemelidir.
• Eğer temas varsa hemen bol su ile yıkanmalıdır.
Kaba Aktarma
• Tartılan besi yeri veya besi yeri bileşenleri uygun bir erlen veya cam balona aktarılır.
• Kullanılan kabın hacmi hazırlanacak besi yeri hacminden daha fazla olmalıdır.
• Özellikle besi yeri bileşiminde agar varsa besi yeri hacmi kap hacminin 2/3 veya 3/4' ünden fazla olmamalıdır.
• Aktarılan kap kuru olmalı, aktarma sırasında kabın ağız kısmına besi yeri veya besi yeri bileşenleri yapışmamalıdır.
Çözündürme
Besi yerlerinde büyük oranda su bulunur. Besi yeri bileşimine giren maddelerin çözelti haline gelebilmesi için su gerekir. Çeşme suyu bileşimi yörelere göre farklılıklar göstermekte ve dezenfeksiyonu için yüksek oranda klorlanmaktadır. Bu sebeple besi yerlerinin hazırlanmasında genellikle saf su kullanılır. Suyunun bileşimini aynı olmadığında mikrobiyolojik analiz sonuçları farklı çıkabilir. Klorun mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkisi vardır. Ayrıca fazla kireçli olan sularda bulunan Cu, Zn gibi metal iyonları da mikroorganizmalara toksik etki yapar.
• Besi yeri hazırlamada kullanılan suyun pH’sı kontrol edilmeli, pH 5.5 değerinin altında ise su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılmalıdır.
• Besi yerine katılacak su miktarını hatalı ölçmemek için önce istenen hacim kadar saf su besi yeri hazırlanacak kaba konarak seviye cam kalemi ile işaretlenip suyun yarısından fazlası başka temiz bir kaba aktarılır.
• Kaba yavaşça az miktarda su eklenerek boğaz kısmında kalmış olan besi yeri veya besi yeri bileşenleri yıkanır.
• Besi yeri veya besi yeri bileşenlerinin çözünmesi için karıştırılır.
• Çözünmenin tam olması ve kaynatma süresinin kısaltılması için oda sıcaklığında 10–15 dakika bekletilir.
• Daha önce işaretlenen yere kadar saf su eklenir.
• Besi yeri veya besi yeri bileşenlerinin tamamen çözünmesi için 50 0C ta su banyosu veya ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda ısıtılır. Eğer besi yerine agar katılmışsa ısıtma işlemi kaynama sıcaklığında (90–95 0C) uygulanır.
• Eritme sırasında erlenin ağzı alüminyum folyo ile kapatılarak buharlaşma ve buharın laboratuvara dağılması önlenmelidir.
• Isıtma işlemi gereksiz yere uzatılırsa buharlaşma ile su kaybı olur.
• Özellikle az oranda agar içeren besiyerlerinde ani kaynama sonucu taşmaları önlemek için kaba cam boncuk konur veya sürekli karıştırılır.
• Besi yeri bileşenleri çok iyi çözündürülmezse sterilizasyon sırasında oluşan Maillard reaksiyonları nedeniyle esmerleşmeler görülebilir, bulanıklık ve çökelti oluşur, istenen pH’yı sağlamak zorlaşır.
Berraklaştırma
• Ürediklerinde bulanıklık oluşturan mikroorganizmaların tanımlanmalarında kullanılan ve doğal çökelti maddeleri içeren besiyerleri berraklaştırılır. Besi yeri;
• Adi filtre kâğıdından veya pamuktan geçirilerek,
• Santrifüjle,
• Kapta bekletilerek kaba partiküllerin çöktürülmesi (sedimantasyon) ile berraklaştırılabilir.
• Besi yerinde çökelmiş veya çözünmemiş partiküller kolonilere benzer görünüm oluşturarak mikroorganizma gelişmesinin değerlendirilmesinde yanıltıcı olabilir.
Besi Yeri pH’sının Ayarlanması
Bileşimine giren maddeleri tamamen çözünmüş, berrak besi yerinin pH’sı sterilizasyon sonrasında istenen pH değerine göre ayarlanır.
Raf ömrü bitmemiş, usulüne uygun olarak depolanmış, hazır ticari besiyerlerinin, saf su ve temiz cam malzeme kullanıldığında kurallara uygun ve doğru olarak hazırlanıp hemen sterilize edildiğinde pH’sında sorun olmaz. Kâğıtta oluşan renk, renk skalası ile karşılaştırılarak besi yerinin pH’sı
belirlenmeye çalışılır. pH kâğıtları besi yeri pH aralığı hakkında kabaca bir fikir verir, kesin olarak pH’yı
belirtmez. pH kâğıtlarının yaklaşık bir sonuç belirtmesi nedeniyle besi yeri pH’ının ölçülmesinde ve ayarlanmasında pH kâğıtları yerine pH metre kullanılır.
pH metre elektrotları ile çözeltideki H+ iyonu konsantrasyonunun sayısal değeri ölçülür. pH metre ile ölçüm yapılırken;
• pH metrenin besi yeri sıcaklığına göre sıcaklığı ayarlanır.
• Tampon çözeltiler (genellikle pH=4 ve pH=7 veya pH=4 ve pH=11 olan
tampon çözeltiler kullanılır) ile pH metre ayarlanır (kalibre edilir).
• Daha sonra pH metre elektrotları besi yerine batırılır.
• pH değeri skaladan okunur.
Besi yerinin pH’sı belirtilen pH’dan yüksek veya düşük olduğunda ayarlanmalı, formülde istenen pH’ya getirilmelidir.
• Besi yerinin pH’sı filtrasyonla sterilize edilmiş 1 N veya 0.1 N HCl ile ya da 1 N veya 0.1 N NaOH kullanılarak ayarlanır. Besi yeri pH’sı istenenden yüksekse 1 N veya 0.1 N HCl, istenenden düşükse 1 N veya 0.1 N NaOH kullanılarak formülasyonunda belirtilen dereceye ayarlanır.
Besi yeri pH’ının ayarlanırken şu noktalara dikkat edilmelidir;
• Besi yerinin pH’sını ayarlanırken besi yeri bir erlene aktarılır, manyetik
karıştırıcı ve ısıtıcıya konur. Besi yerine duruma göre damla damla 1N veya 0.1
N NaOH ya da 1N veya 0.1 N HCl eklenerek pH ayarlanır.
• pH ayarlaması sırasında asit veya baz damlalarının elektrotlara değmemesine
dikkat edilmelidir.
• Besi yerinde agar varsa agarın katılaşmaması için besi yeri 45 – 480C’ye kadar
soğutularak pH ayarlanır. Bu durumda pH metre kalibrasyonu da 45 – 48 0C’de
yapılmalıdır.
• Besi yerinin pH’ında sterilizasyon sonunda 0.2 – 0.4 kadar düşme olabilir.
Bunun için ya besi yerinin pH’ı istenenden 0.2 – 0.4 kadar yüksek ayarlanır ya
da besi yerine PO4 tuzları gibi tampon maddeler ilave edilir.
• Gıda işletmelerinde her otoklavlama sonrası mutlaka pH kontrolü yapılmalıdır.
•
Besi Yeri Hazırlanan Kaplara Hazırlama Bilgilerini Yazma
Hazırlanan besi yerlerinin hemen sterilize edilmesi gerekir. Sterilize edilmeden oda sıcaklığında bekletilen besi yerlerinde mikroorganizma gelişir ve bozulur. Bozulmuş besi yerleri de mikrobiyolojik analizlerde kullanılamazlar. Bekletilmeden kullanılması önerilen besi yerleri dışındakiler ve kısa bir süre sonra sterilize edilecek besi yerleri burgulu veya şilifli şişelere konarak buzdolabında bekletilebilir.
Besi yeri şişesi üzerine;
• Besi yerinin adı,
• Hazırlandığı tarih,
• Hazırlanan miktarı(hacim),
• Hazırlayan kişinin adı yazılır.
Besi Yerlerini Sterilizasyona Hazırlama Aşamaları
• pH’sı ayarlanan besi yeri istenen yönteme ve amaca göre sterilizasyona hazırlanır;
• EMBAgar, SSAgar, PCA, PDA gibi besi yerleri bulundukları cam kaplarda
• sterilizasyona hazırlanır.
• Besi yeri bulunduğu kaptan erlen, balon veya tüplere belirli hacimlerde
• dağıtılarak ağzı pamuklanır ve alüminyum folyo ile kapatılır.
• Durham tüplü besi yeri hazırlanacaksa Durham tüpleri, test tüplerine ters olarak
• yerleştirildikten sonra besi yeri konur, tüplerin ağzı pamuklanır.
• Besi yeri burgulu veya şilifli rock şişesine konmuşsa kapaklar gevşek bırakılır.
• Petri kutularında besi yeri sterilize edilmez.
Petri Kutularına Döküm
Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla Petri kutularına dökülerek kullanılır. Besiyeri dökülmeden önce, homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır. Agarlı besiyerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar ile Roux şişelerinde kullanım sayılabilir. Bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besiyeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. Ancak, agarlı besiyerlerinin Petri kutularında sterilize edilmesi uygulanan bir yöntem değildir. Agarlı besiyerleri, her zaman erlen gibi büyük kaplarda sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril Petri kutularına aseptik koşularda dökülür. Bazı işletmelerde "el altında" bulundurma amacı ile eritilmiş agar tüplere dağıtılır, sterilize edilir ve bu şekilde korunur. Gerektiğinde eritilip Petri kutusuna aktarılır.
Petri kutularına dökülecek agarlı besiyeri miktarı farklı kaynaklarda farklı değerler ile verilmektedir. Bu miktar, öncelikle Petri kutusu çapı ile ilgili olduğu için agarlı besiyeri döküldükten sonra kalınlığın "en az 2–3 mm" olması yaygın bir şekilde önerilmektedir. Bu kitapta önerilen standart dökme miktarı 12,5 mL'dir (100 mL agarlı besiyerinin 8 Petri kutusuna dağıtılması; standart 9 cm çaplı Petri kutusunda 2 mm kalınlık). VRB Agar besiyerinde dökme yöntemi ile kültürel sayımda 10 mL besiyeri dökülmesi, jelleştikten sonra üzerine 4–5 mL besiyeri ilavesi pek çok uluslararası standart tarafından önerilmektedir.
Agarlı besiyerinin otoklavlama sonrası Petri kutusuna hangi sıcaklıkta döküleceği konusunda pek çok yanlış uygulamaya rastlanmaktadır. Agarlı besiyeri için doğru uygulama şekli, otoklav sonrası besiyerinin yaklaşık 45 oC'a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri kutularına dökülmesidir. Yüksek sıcaklıklarda dökme, Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su yoğunlaşmasına yol açar. Ayrıca yüzey kurutması daha uzun zaman alır.
Eğer Petri kutusunda "dökme yöntemi ile kültürel sayım" amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 40 oC'ı geçmemelidir. Bu uygulamada dikkat edilmesi gereken bir diğer özellik, Petri kutusunda bulunan mikroorganizmaları olası termal şok zararlarından korumak için Petri kutularının oda sıcaklığında tutulması gerekliliğidir.
Herhangi bir nedenle otoklavlandıktan sonra 50 oC su banyosunda uzun süreli beklemeler agarın jelleşme özelliğinde kayıplara neden olur. 48 oC'da 4 saat beklemek izin verilebilecek en yüksek sıcaklık/süre kombinasyonudur.
Besiyeri döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya bırakılır. Yayma yöntemi ile çalışılacak ise dökme sırasında besiyerinde oluşabilecek hava kabarcıkları bunzen beki alevi ile uzaklaştırılabilir.
Agarlı besiyerleri dökümden sonra bir süre depolanacaksa Petri kutularının tabanına döküm tarihi yazılmalıdır.
03.06.06. Kurutma
Petri kutularına dökülmüş agarlı besiyerlerinde yüzeyin ıslak olması istenmez. Islak yüzeylerde hareketli bakteriler yayılıcı tip koloni oluştururken, hareketsizler olduklarından daha büyük koloni meydana getirir ve yanlış değerlendirmelere neden olur.
Tersine olarak, aşırı kurumalar da olumsuz sonuç verir. Koloniler aşırı kurumuş bir besiyerinde normalinden daha küçük boyut oluşturacakları için yine hatalı değerlendirmelere neden olur.
Kurallara uygun olarak Petri kutularına dökümde yüzey hafif nemli olur. Öze ile sürme gibi bir çalışma yapılacaksa, kurutma özellikle yapılmalıdır. Besiyerinin kurutma gerektirip gerektirmediği basit olarak yüzeyde su damlacıklarının görülmesi ile anlaşılır.
Petri kutularında agarlı besiyeri yüzeyinin çabuk kurutma yönteminde (a), kuruma hızlı olur, ancak kontaminasyon riski yüksektir. Diğer uygulama (b), tersine olarak geç kuruma ancak düşük kontaminasyon riski sağlar. Prensip olarak benimsenen şekil güvenli kurutmadır. Çabuk kurutma sadece acil durumlarda uygulanmalıdır.
Kurutma, mutlaka temiz ve serbest hava akımı olmayan yerlerde yapılmalıdır. Steril hava akımı ile çalışan aşılama kabini (Laminar air flow), sterilizasyon amacıyla kullanılan ve kurutma sırasında çalıştırılmayan etüvler (kuru hava sterilizasyon fırını) ve UV lamba ile sterilize edilen kabinler kurutma için kontaminasyon olmaması açısından en güvenilir yerler arasındadır. Kuru hava sterilizatörlerinde kurutma sırasında sıcaklığın 50 oC'da tutulması hızlı bir kuruma sağlar. Ancak bu uygulamada besiyerinin aşırı kuruma riski de vardır.
Hazırlanmış Besiyerlerinin Depolanması
Çoğu laboratuvarda, besiyerleri hazırlandıktan sonra sterilize edilir ve daha sonra kullanmak üzere depolanır. Bu uygulamaya çeşitli besiyeri katkıları da girer. Benzer şekilde kullanıma hazır halde Petri kutularında, vida kapaklı şişelerde vb. şekillerde kullanıma hazır halde besiyerleri sağlanabilmektedir
Hazırlanmış besiyerlerinin stabilitesi sınırlıdır. Bunların depolanabilme süresi öncelikle bileşimine ve saklama koşullarına bağlıdır. Her laboratuvar, kendi hazırlama, paketleme ve saklama koşullarına göre hazırlanmış her besiyeri için depolama süresini belirlemeli, bu şekilde talimatlara geçmelidir.
ISO 11133'e göre besiyerleri katkı ilave edilmemiş olmak kaydı ile buzdolabında en çok 3 ay, oda sıcaklığında en çok 1 ay süre ile depolanabilir. Bununla birlikte, bazı besiyerlerinin hazırlandığı gün kullanılma zorunluluğu vardır. Laboratuvar personeli bu konuda çok dikkatli olmalıdır.
Hazırlanmış besiyerlerinin ne kadar süre ile depolanacağı öncelikle besiyeri bileşimine, hangi ambalajda (tüp, vida kapaklı şişe, plastik Petri kutusu, cam Petri kutusu vb.) olduğuna, depolama koşullarına bağlıdır. Genel olarak, basit bileşime sahip ve içinde katkı içermeyen besiyerleri, diğerlerine göre daha stabildir ve buna bağlı olarak daha kolay depolanabilirler.
Hazırlanmış besiyerlerinde raf ömrünü belirleyen en önemli faktörler, ışık, nem ve sıcaklıktır.
Diatek tarafından satın alabileceğiniz Hazır besiyerleri ve Toz besiyerleri analizlerinizde başarılı sonuçlar almanızı sağlar.