Gıdalarda çok çeşitli amaçlarla protein analizleri yapılmaktadır.
Örneğin;
1.
Gıda maddesinin mevcut kalite standartlarına uygunlunun belirlenmesi
acıyla: Örneğin; bir çok standartta her bir gıda maddesi için protein
oranı, şu standartdan aşağı olamaz gibi kriterler konulmuştur,
2.
Gıda maddesinin besleme değerini belirlemek amacıyla: Gıdaların besleme
içeriği toplam ham protein miktarının haricinde diğer bazı kalite
indeksleri ile de belirlenmektedir, örneğin; PER (Protein EffIciency
Ratio), BV (Biological Value), *U (Net Protein Utilization) ve EAO
(Esansiyel Amino asit Oranı) gibi,
3. Proteinlerin bazı
fonksiyonel özelliklerini belirlemek amacıyla: Örneğin; emülsiyon
stabilitesi, emülsiyon kapasitesi, su ve yağ bağlama kapasitesi, köpük
oluşturma, jel kuvveti, çözünürlük vb kalite özellikleri ile de
proteinler hakkında bilgi edinilir,
4. Proteinlerin bazı
teknolojik özelliklerinin belirlenmesi amacıyla: Örneğin; canda sayılan
fonksiyonel özeliklerin gıda işleme açısından uygunluğu,
5. Bir gıda maddesinin genel bileşiminin tespit edilmesi amacıyla,
6.
Satışa sunulacak gıda maddesinin fiyatını ayarlamak amacıyla: Genel
olarak bir gıdanın proteini ne kadar çoksa, o gıda maddesi de o kadar
değerlidir,
7. Herhangi bir işleme tekniğinin proteinler
üzerindeki etkisini belirleri amacıyla: Örneğin; sterilizasyon,
pastörizasyon,fermantasyon vb işlemlerin g proteinlerine etkisini
belirlemek gibi.
8. Gıda içerisindeki protein çeşitleri veya bunların yapısal özellikleri belirlenmesi amacıyla.
Proteinlerde Bulunan Toplam Azotun (N) Dikkate Alındığı Metotlar
Bu
metotların esası, gıda maddesindeki N'in büyük bir çoğunluğunun
proteinlerde bulunduğu noktasından hareket ederek bu azotun miktarının
belirlenmesine dayanır. Diğer bir anlatımla, N'nin proteinler içindeki
oranın sabit olduğu prensibi esas alınır ve azot miktarının tayin
edilmesi ile gıda içerisindeki protein oranının da belirlenmiş olur.
Yapılan
çalışmalar, gıda içerisinde bulunan N'un % 99'nun proteinlerden Iti
saklandığını ortaya koymuştur. Ancak, protein tabiatında olmayan diğer
bazı gıda bileşenlerinin de azot ihtiva ettiği bilinmektedir. Bu
bileşiklerden bazdan; N'li SEL-Tonhidratlar, lipitler, (lesitin vb)
nükleik asitler, pürin bileşikleri, porfirinler, çeşitli pigmentler,
serbest amino asitler, peptitler, üre, amonyum tuzlan, amin ve amid
bileşikleri ve çeşitli alkaloitler ile NO2 ve NO3 gibi diğer bazı
bileşiklerdir. İşte toplam azotun esas alındığı protein tayinlerinde,
protein tabiatında olmayan azot da belirlendiği için bu metoda,
genellikle ham protein (crude protein) tayini adı verilir. ancak,
yukarıda sayılan bu N'li bileşiklerin gıda maddelerindeki miktarlarının
çok küçük olduğu bilindiğinden ham protein çoğu zaman gerçek protein
oranı gibi değerlendirilmektedir.
Yapılan araştırmalarda
proteinlerin yaklaşık % 16'sının N, geri kalan bölümünün K C, H ve O'den
ibaret olduğu bulunmuştur (daha öncede ifade edildiği gibi proteinler,
çok az miktarda S, P ve Fe gibi başka elementler de ihtiva
edebilmektedir). Ancak proteinlerdeki en düşük N oranı; %4.2 ile (3
lipoproteinIer de, en yüksek N oranı ise; %30 ile protaminler de tespit
edilmiştir.
Sonuç olarak protein tayininde, önce t-ia
içerisindeki N miktarı bulunur ve bu değer bir faktör (100/16=6.25) ile
çarpılarak protein miktarı hesaplanır. Ancak, gıda maddelerinin N oranı
değişebildiği gibi gıda celisinde bulunan diğer bazı azotlu maddelerin
oranı da farklı olabilir. Bu konuda ip ilan araştırmalar sonucu, her bir
gıda maddesi için belirli katsayılar belirlenmiştir, örneğin, bazı
gıdalar için bu katsayılar (faktörler) şöyledir;
Et, yumurta, fasulye, balık vb gıdalar için; 6.25
Süt ve mamulleri için; 6.38
Hububatlardan, arpa, çavdar, yulaf için; 5.83
Buğday, un vb tahıllar için; 5.70
Jelatin; 5.30
Kabuklu yemişler için ise; 5.30
Yukarıda da görüldüğü gibi bazı gıdalar için belirlenen bu oranların olmasının en önemli nedenleri şunlardır:
1. Gıda içerisindeki N'nin tamamı protein kaynaklı olmayabilir,
2. Protein tabiatında olamayan N'li bileşiklerinin oranlan farklı olabilir,
3. Her proteinin amino asit oranlan, dolayısıyla N miktarları farklıdır,
4. Bir gıdada değişik yapıdaki proteinlerin oranlan farklıdır.
Daha
önce de belirtildiği gibi genel olarak 3 değişik yöntemle toplam eleme
-azot tayini, dolayısıyla de protein tayini yapılabilmektedir. Bu
metotlarla toplan: tayininde, önce gıda içerisindeki azot, elemental N
haline veya amonyum tuzlan dönüştürülerek bunların miktarı; titrimetrik,
kolorimeirik yöntemler, iyon spesifik elektrotlan veya termal
iletkenlik detektörleri ile belirlenir. Daha sonra bulunan miktan,
yukarıda verilen faktörlerle çarpılarak analiz edilen örneğin protein on
belirlenir. N'nin dikkate alındığı protein tayin yöntemi aşağıda açıklanmıştır.
Yöntem,
örnekte organik bileşikler halinde bulunan azotun bir katalizör
eşliğinde derişik H2S04 ile yaş yakma işlemi sonucunda indirgenerek
amonyum azotu haline dönüştürülmesi ilkesine dayanır. Azot, amonyum
azotu haline dönüştürüldükten sonra kuvvetli alkali ortamda damıtılarak
açığa çıkan amonyak bir asit içinde tutulur ve titrasyon ile miktarı
belirlenir. Titrasyon sonucu yapılan hesaplamayla bulunan azot miktarı
bir katsayı ile çarpılarak örnekteki protein miktarı belirlenir. Bu
katsayı genellikle 6.25 olup, süt ve ürünlerinde 6.38, tahıl ve
ürünlerinde 5.70'dir. Kjeldahl yöntemi ile protein halinde bulunmayan
amin, amid ve amonyum gibi azotlu bileşikler de protein gibi
belirlendiğinden bazı durumlarda azotlu bileşikler için "ham protein"
ifadesi kullanılır.
Kjeldahl yöntemi; yakma, damıtma ve titrasyon
aşamalarından meydana gelmektedir. Bu aşamalarda meydana gelen
reaksiyonlar şu şekilde gösterilebilir:
Çözeltiler:
1. Derişik H2SO4 = % 98'lik ve d : 1.84 g / cm3
2.
Yakma tuzu karışımı (Katalizör)* 100 g azot içermeyen K2S04 , 10 g
CuS04. 5H20 ve 1 g toz halindeki selenyum iyice karıştırılır ve
gerektiğinde bir havanda dövülerek toz haline getirilir.
3. % 40'lık NaOH çözeltisi* 400 g NaOH damıtık su ile litreye tamamlanır.
4.
% 2'iik H3BO3 çözeltisi* 20 g saf borik asit (H3B03) damıtık su ile
litreye tamamlanır. Çözünmeyi kolaylaştırmak için gerektiğinde içerik
hafifçe ısıtılabilir.
5. 0.1 N H2SO4 çözeltisi* 1 litrelik ölçü
balonu yaklaşık yarısına kadar damıtık su ile doldurulur. Üzerine 2.7 mL
H2S04 (% 98Tık =1.84 g/cm3) çözeltisinden yavaş yavaş ilave edilip ölçü
balonu damıtık su ile çizgisine tamamlanır. Çözeltinin ayarı standart
(ayarlı) baz çözeltisi ile yapılır.
6. Metil kırmızısı-bromkresol
yeşili indikatörü* 0.02 g metil kırmızısı ve 0.10 g bromkresol yeşili
100 mL % 95'lik etil alkol içerisinde çözülür.
Işlem:
Yakma:
1.0 ± 0.001 g örnek tartılarak yakma tüpüne alınır. Üzerine yaklaşık 6.0
g yakma tuzu karışımı konulur. Daha sonra 15 derişik H2S04 eklenir.
Yakma tüpüne derişik H2SO4 ilave edilirken tüp hafifçe eğik tutulup
yavaş yavaş döndürülerek, tüpün iç yüzeyine yapışan örnek ve yakma tuzu
parçacıklarının tüpün dip kısmına yıkanması sağlanmalıdır.
Bu
işlemlerden sonra yakma tüpü aletin yakma setine konur ve önce 200-250°C
arasında 15-20 dakika ön yakma yapılır. Bu işlem ile başlangıçta
yanmakta olan maddelerin köpürüp taşması engellenmiş olur. Daha sonra
sıcaklık 380°C'a getirilerek asıl yakma işlemine geçilir. Asıl yakma
işlemi 30-45 dakika sürer ve başlangıçta, siyah olan ortam rengi
kahverengine döner. Yakma süresinin sonuna doğru karbonlu parçaların
oksitlenmesi ile karışımın rengi berraklaşır ve uçuk sarı ile parlak
yeşil arası bir renk alır. Bu yakma işleminin tam anlamıyla bittiğini
göstermediği için, karışımın berraklaşmasından sonra yakma işlemine
380°C'de en az 20-30 dakika daha devam edilir.
Yakma işlemi
tamamlandıktan sonra tüpün yaklaşık 40°C'a kadar soğuması için 10-15
dakika beklenir. Süre sonunda tüpe, iç yüzeyinden ince bir tabaka
halinde akacak şekilde, yaklaşık 40 mL damıtık su ilave edilir. Bu işlem
sırasında tüp yavaş yavaş döndürülerek iç yüzeyin yıkanması sağlanır ve
tüp hafifçe çalkalanır.
Damıtma: Damıtma sırasında çıkan amonyağı
tutmak için, 300 mL'lik bir erlenmayere 50 mL %2'lik H3BO3 çözeltisi
konur. Üzerine 5-6 damla karışık indikatör damlatılır ve erienmayer
damıtma cihazının soğutucusunun altına yerleştirilir. Soğutucunun ucu
borik çözeltisinin içerisine bir kaç mm girmelidir. Bu hazırlıklardan
sonra yakma tüpü damıtma cihazındaki yerine takılır ve üzerine 75 40'lık
NaOH çözeltisi eklenerek damıtmaya başlanır. Damıtma işlemine
erienmayer içerisindeki toplam hacim yaklaşık 150 mL oluncaya kadar
devam edilir.
Titrasyon: Damıtma sırasında çıkan amonyak,
erienmayer içerisindeki borik asit ile birleşerek amonyum borat
oluşturur. Oluşan amonyum borat miktarı, erienmayer içeriğinin 0.1 N
H2SO4 çözeltisi ile titrasyonu sonucunda bulunur. Çözeltinin rengi açık
pembe renge dönünce titrasyona son verilir. Bu şekilde ortamda bulunan
amonyum borat tekrar borik asite dönüştürülmüş olur.
Not: Yakma aşamasından itibaren, örnek dışında, bütün kimyasal madde ve çözeltiler kullanılarak bir şahit deneme yapılır.
Hesaplama:
% Azot Miktarı (g/100g) = / Ö x 100
% Protein Miktarı = % Azot miktarı x 6.25
Vı = Esas deneme için titrasyonda harcanan 0.1 N H2S04 miktarı (mL)
V2 = Şahit deneme için tıtrasyonda harcanan 0.1 N H2S04 miktarı (mL)
N = Titrasyonda kullanılan H2SO4 çözeltisinin kesin normalitesi
Ö = Örnek miktarı (g)