Escherichia coli ve Coliform Bakterilerin Araştırılması ve Saımı ve
Membran Filtreleme Yöntemi (TS ENISO9308‐1).
Su numunesinin belirli bir hacmi membran filtreden geçirilir; membran filtre bir seçici besiyerine konulur;
* 36°C ± 2°C ve 44°C ± 1°C sıcaklıkta 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saatinkübe edilir;
* Laktoz Pozitif olarak tanımlanmış olan tipik koloniler okunur ve sayılır;
* Koliform veya Escherichia coli olarak doğrulanmış tipik koloniler sayılır.
Coliform bakteriler: 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saat içerisinde 36°C ± 2°C sıcaklıkta seçici kültür ortamında laktozdan asit oluşturan,fakültatif anaerob ve oksidaz negatif bakterilerdir
Escherichia coli : 44°C ± 1°C sıcaklıkta 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saatiçerisinde triptofandan indol oluşturan koliform bakterilerdir.
Seyreltici
– Tuzlu peptonlu su: TPS
Seçici kültür ortamı
– Tergitol TTC laktozlu agar (GBL-0240)
Doğrulayıcı kültür ortamı ve reaktifler
– Seçici olmayan agar: (Triptofan Soy Agar (TSA) gibi) (GBL-0361)
– Triptofan buyyonu
– Oksidaz reaktifi (GBL-0534)
– Kovaks reaktifi (GBL-0525)
Filtreleme:
* İncelenecek numune çalkalanarak homojenleştirilir;
* Laboratuvar içerisinde hazırlanan talimat doğrultusunda numunenin cinsine göre 100 veya 250 mL membran filtreden geçirilir ve membran filtre TTC‐Tergitol laktozlu agar besiyeri (GBL-0098) üzerine yerleştirilir;
* İşlem, istenmeyen üremenin engellenmesi amacıyla 44ºC’de inkübe edilecek diğer petri için ikinci kere tekrarlanır.
İnkübasyon:
* Bu şekilde hazırlanmış petrilerden biri 21saat ± 3saat boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir. Deneyin hassasiyetini arttırmak için süre 44saat ± 4saate uzatılıp ikinci okuma işlemi gerçekleştirilir.
* Diğer petri 21saat ± 3saat boyunca 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir. Süre 44saat ± 4saate uzatılıp ikinci okuma işlemi gerçekleştirilir.
Okuma:
* Genellikle koliformlar, membranın altından görülebilen sarı bir hale içerisinde sarı veya turuncu renkte koloniler oluştururlar. Escherichia coli ve Enterobacter aerogenes kolonileri, en sarı renkteki kolonilerdir. Bazı koliform bakteriler yeşilimtrak veya pembe koloniler de oluşturabilmektedir.
* Az bile olsa, sarı bir halenin olması, doğrulaması yapılacak şüpheli kolonileri işaret etmektedir.
* Ancak, her ne kadar ikincil bir gösterge oluşturuyor olsa da, doğrulaması yapılacak kolonlerin rengi dikkate alınmalıdır. Böylece, sarı bir halenin olması halinde, doğrulanacak koloniler öncelikli olarak sarı (ortasında pas olan veya olmayan) ve kırmızı turuncu kolonilerdir; daha az temsil edilen yeşilimtrak veya pembe koloniler de doğrulanmalıdır.
Doğrulama ve sayım:
Aşağıdaki durumlar hariç, ileri ekimler öncelikli olarak 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petrilerden yapılmaktadır.
* Eğer 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petri üzerinde daha fazla sayıda tipik koloni var ise; bu durumda, 36°C ± 2°C ve 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petrilerin tipik kolonileri doğrulanır,
* Eğer 36°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petri istenmeyen flora ile istila edilmiş ise (100-150’den fazla karakteristik olmayan koloni); bu durumda, sadece 44°C sıcaklıktaki petride bulunan koloniler doğrulanır.
Oksidaz:
* TSA (GBL-0361) üzerine ekim yapılır ve 21saat ± 2saat boyunca 36°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir;
* İki‐üç damla taze hazırlanmış oksidaz reaktifi (GBL-0534) bir süzgeç kağıdı üzerine damlatılır.
* Cam, tahta, plastik veya platin (nikel krom olmayan) öze ile TSA’da oluşan koloninin bir kısmı hazırlanan süzgeç kağıt üzerine sürülür. 30 sn içerisinde koyu mavi‐mor rengin oluşması pozitif reaksiyon olarak kabul edilir.
Coliform bakteriler oksidaz negatiftir: Kağıt üzerinde renklenme gerçekleşmez.
İndol üretimi:
* Triptofan buyyonu tüpüne ekim yapılır ve 21saat ± 3saat boyunca 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir;
* 0,2‐ 0,3 mL Kovaks reaktifi (GBL-0525) konarak indol üretimi kontrol edilir.
Buyyonun yüzeyinde kırmızı rengin oluşumu indol üretimini doğrular.
Diatek olarak ürün portföyümüzde su analizlerinde Hypet Aqua (Su mikrobiyolojisi) serimizdeki hazır besiyerlerini kullanabilirsiniz. Su analizlerinizi membran filtrasyon metoduyla gerçekleştirebilirsiniz.